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质粒作为重组DNA技术的核心工具，是合成生物学“设计-构建-测试-学习（DBTL）”循环的关键环节。然而，复杂质粒的构建长期面临以下挑战：

序列依赖性强：现有方法（如GoldenGate组装、Gibson组装等）受限于酶切位点、GC含量、重复序列等因素，限制了复杂DNA序列的组装；

操作繁琐：多片段组装需反复尝试不同方法（如Gibson组装、GoldenGate等），耗时且成功率低；

自动化瓶颈：现有自动化平台多依赖固定酶切位点或需引入冗余序列，难以实现“任意序列”的灵活构建。

如何开发一种序列无限制、高精度、全自动的质粒构建平台，成为合成生物学领域的迫切需求。

美国伊利诺伊大学香槟分校的研究团队在《自然·通讯》（NatureCommunications）发表题为“PlasmidMaker：一种通用、自动化、高通量的端到端质粒构建平台”的研究论文，展示了其开发的PlasmidMaker平台如何通过高度集成的自动化流程，实现复杂质粒的高效精准构建。其核心创新包括：

PfAgo酶介导的DNA组装  

• 利用PyrococcusfuriosusArgonaute（PfAgo）作为可编程人工限制酶，通过向导DNA（gDNA）指定切割位点，支持任意序列设计，无酶切位点限制，可处理高GC含量（达77%）及重复序列。           

端到端自动化流程

• 集成用户友好的质粒设计界面、自动化组装算法（支持多片段并行处理），以及iBioFAB（IllinoisBiologicalFoundryforAdvancedBiomanufatcuring）机器人系统——iBioFAB集成液体处理、温控、离心机、撕封膜等设备与大机械臂协作，实现从序列设计到质粒组装的全程自动化、实现“设计-构建-验证”闭环。

PlasmidMaker平台概述        

PlasmidMaker平台用于从线性DNA片段构建质粒的设计、构建和测试循环。在设计中，使用前端设计并选择用于组装的DNA片段。所有选定序列通过质量检查后，生成Worklists以进行引物和导向序列的大规模合成。 

接收到的引物和导向序列以96孔或384孔格式转移到相应的目标孔中，通过液体处理系统进行PCR 反应以生成特定的DNA片段。接下来，在iBioFAB内进行酶切、连接和转化以组装DNA片段。 

使用基于PfAgo的人工限制酶（AREs）进行DNA组装。首先，线性DNA分子的末端与野生型和工程化PfAgo/AREs一起进行酶切消化，生成12nt长度的5′粘性末端。纯化后，酶切过的DNA分子在体外使用高保真DNA连接酶连接，并将连接产物转化到大肠杆菌细胞中进行筛选。最后，构建的质粒通过自动化系统进行确认，并储存正确的质粒。

自动化DNA组装过程的工作流程概述        

图2a在线订购系统接收待组装的质粒订单。接收到的质粒序列经过注释和处理，以生成引物、导向序列和液体处理的Worklists。    

图2b用于设计DNA导向序列和选择酶以实现高效PfAgo基础组装的算法。使用质粒的注释片段作为输入，从片段的连接处创建导向搜索空间。根据片段的GC含量和导向搜索空间，提供建议使用WT PfAgo和PfAgo或仅使用PfAgo。从导向搜索空间创建的导向库被扫描以识别用于高保真度质粒组装的24bp识别序列。一旦获得满足PfAgo消化和Hifi Taq连接设计规则的导向序列，识别序列即被最终确定。

图2c用于生成PfAgo基础质粒组装的液体处理Worklists的工作流程。使用包含每个质粒在96孔/384孔板中引物/导向序列位置的参考csv文件，创建液体处理步骤以混合引物和模板、混合导向序列，随后进行纯化PCR片段的等摩尔混合。

Fluent液体处理工作站的具体应用 

整个自动化工作流程由三个主要模块组成： 

模块1：通过PCR和纯化进行样品准备

模块2：自动化DNA组装和转化

模块3：质粒纯化、确认和冷藏保存的样本准备

Fluent液体处理工作站在PlasmidMaker平台中展现了其在精准液体处理、高通量操作与流程集成方面的优势，为复杂质粒的高效构建提供了可靠的技术支持。 

在PlasmidMaker平台上，研究人员成功构建了101个质粒，跨越6个不同的物种（细菌、酵母、植物和哺乳动物），涉及约2×10⁴次自动化移液步骤。质粒大小范围为5–18kb，由多达11个DNA片段组装而成，几乎不需要人工干预。

这一研究不仅推动了合成生物学工具的发展，也为自动化实验流程的设计提供了重要参考。未来，随着更多实验室采用类似集成化平台，Fluent液体处理工作站有望在生命科学领域的高通量研究中发挥更广泛的作用。