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在生物医学实验室里，酶联免疫吸附测定（ELISA）堪称免疫化学分析的 “主力军”。不过，传统的手动ELISA操作可太 “耗时废人” 了！基于试剂盒的检测一次就得花上3小时，要是用实验室内部方法，甚至长达6小时。其中操作人员的操作时间大约2-3小时，步骤繁多，还容易出错。通过使用FreedomEVO®自动化平台，可完全替代手工操作，使ELISA检测完全自动化。它大幅减少人工干预，降低错误率，还能提升实验室内和实验室间检测结果的重复性与工作效率。今天，就和大家深入聊聊自动化ELISA的那些事儿。

自动化ELISA原理     

自动化分析基于夹心法ELISA。使用特异性生物素化抗体进行捕获步骤，并使用特异性辣根过氧化物酶（HRP）结合抗体，与 3,3’5,5’- 四甲基联苯胺（TMB）发生反应，在650nm处检测信号变化（图1）。

硬核自动化技术     

FreedomEVO150/8是一种灵活的模块化工作站，能根据不同ELISA检测需求灵活配置。它配备了液体置换原理的8通道移液机械臂™（Liquid LiHa），可搭配50、200和1000µl一次性吸头，用于最多至1536孔板的液体移取；以及转板机械臂™（RoMA），用于微孔板或其他器皿在工作台和系统外设备之间地精准转移。该系统整合Sunrise™吸光度酶标仪进行实验结果分析。最重要的是，该工作站符合21CFRPart11GMP法规要求，支持电子记录与数据管理。  

智能脚本开发

ELISA流程是使用FreedomEVO软件编写脚本实现的，用户使用直观的拖放脚本命令可准确再现工作台布局和实验流程。工作台面布局是专为该流程而设置，设有标准品、待检样品和对照的专有位置（图2）。直观且灵活的软件使ELISA实验的所有操作步骤自动化，包括标准品制备、样品制备、板洗涤、不同震荡和温度条件下的孵育以及板读取。多次重复相同的动作列表可通过子程序实现。

ELISA脚本包含以下步骤：  

1. 5-9点标准曲线制备   

2. 样品制备稀释，包括在深孔板中预稀释（子程序）    

3. 板洗涤（子程序）    

4. 试剂添加（抗体、TMB 等）    

5. 在温控震荡器上孵育，提供不同的震荡和温度条件    

6. 读板

最终基于96孔板的定量检测流程由主程序和2个子程序组成（具体图3）

在流程开发过程中，液体的物理化学特性对最终结果产生了影响，主要是由于气泡的形成。可通过软件开发针对性的特定液体类型确保正确移液和成功的脚本开发（图4）。

对结果产生影响的第二个因素是样品稀释（图5），目的是更大程度地减少复杂样品基质对纯化样品的干扰。在这里，FreedomEVO平台表现出了特别的优势，它支持自动稀释和评估关键方法验证参数（线性、精密度、准确性）。

自动化工作站可实现过夜处理，因此稳健性评估非常具有挑战性。与手动检测不同，试剂的隔夜稳定性——尤其是检测阶段使用的试剂的光敏性——需要确定，以评估创建高通量方法的范围。

用数据说话：结果对比     

标准曲线         

手动和自动ELISA都进行了三次重复实验。通过四参数Marquardt拟合和Magellan™软件分析，从结果可以看出，两者制备的标准曲线表现都很出色，每个标准曲线点的变异系数（CV）和百分回收率都在合理范围内。

样品稀释线性  

ELISA验证的主要因素之一是确认样品稀释范围。本研究对标准样本和过程控制样品进行连续稀释，分别用手动和自动化方法检测。以80-120%的回收率作为标准，两种方法对这两种样品类型的检测结果都不相上下。（表1和表2）。 

结论：自动化大势所趋    

过程验证复杂且耗时，尤其是高通量处理时。工作流程的自动化可以帮助技术人员提高通量和准确性。本应用文献中展示了FreedomEVO自动化平台和手动处理ELISA流程在线性、准确性和精确性方面的可比结果。这些结果以及脚本的未来优化，将提高实验室ELISA实验的执行力，减少运行检测所需的时间并增加通量。结合自动生成数据的完整性，这意味着以后能在更短时间内开展更可靠的研究，加速高质量药物的研发与评价！