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基于质谱的血浆蛋白质组学仍然面临着一些重大挑战，包括血浆蛋白质组的复杂性和宽广的动态范围。因此，需要先进的样本制备技术来富集低丰度蛋白质，然而手动处理大队列样本需要大量的动手时间，不仅会降低研究速度，还会有人为错误的风险。自动化技术可以解决这些难题，确保大量样本的快速处理，同时提供可扩展性和结果的可重复性。

ENRICH-iST试剂盒（PreOmics）工作流程为高通量和深入的血浆蛋白质组分析提供了标准化的简化的解决方案，通过将低丰度蛋白质富集到顺性磁珠上，有效打破了动态范围的限制，同时保留了有价值的生物信息。富集后的蛋白质使用iST工作流程步骤进行酶解和纯化，以进行MS分析。

为了进一步提高血浆样本制备工作流程的效率，将此试剂盒与TECANFluent液体工作站相结合实现了全自动化（见图1），其中，Fluent工作平台可实现蛋白富集，蛋白酶解，纯化，肽段浓缩干燥、重悬等一系列的工作流程（见图2），极大限度提高了前处理效率，96个血浆样本到干燥的多肽在6h内即可完成。为了评估此平台的可靠性和稳健性，本文对多日的自动化工作流程进行了严格的评估，并在一项研究中对其进行了进一步的测试，考察了两个年龄组之间与年龄相关的血浆蛋白质组差异。

结果分析

多日分析旨在确定日内和日间可重复性，以评估ENRICH-iST自动化方案的稳健性。在连续三天的3次独立实验中，对来自单一供体的血浆进行处理，每次实验均采用相同的板布局。三天血浆样本的TIC叠加图显示样本制备都是干净的，无论哪天的色谱分离结果都具有可重复性。此外，血浆样本、相邻空白样本和LC-LOAD缓冲液对照之间的总蛋白丰度比较证实，在自动化处理过程中不存在交叉污染。

在三次实验中，前体和蛋白质组的数量分别超过了12000个和1100个，比较其鉴定出的蛋白质种类时，结果显示有96%的重叠，表明血浆蛋白质组的覆盖范围很深，且有可重复性。

为了进一步评估定量精确度，计算了蛋白质丰度的变异系数，并与作为参考的混合血浆样本进行了比较。对混合血浆多肽样本连续进样五次并分析，得出LC-MS仪器的变异系数中位数为10%CV。对单个血浆样本进行日内分析发现，三次实验的变异系数中位数分别为15%、14%、16%。这表明样本处理过程中涉及的因素对总体变异系数中位数影响很小。此外，日间比较显示所有实验的变异系数中位数为16%，更加表明此自动化工作流程对血浆分析的定量非常可靠。

最后，对两个健康年龄组的年龄依赖性血浆蛋白质组进行了差异分析，在六个个体中，鉴定出的蛋白质组平均数量（约1700个蛋白质组）非常一致，进一步证明ENRICH-iST自动化工作流程的稳健性。差异分析显示年轻或年长供体中存在差异调控的多个蛋白质。据报道，差异调控的蛋白质中有8种是受年龄调控的（红色标记），其中包括GDF15（一种已确立的衰老生物标志物）和热门的CHI3L1（已被证明会随着年龄而升高）。

结论

Fluent自动化液体工作站可成功实现ENRICH-iST样本制备技术自动化流程，极大限度的减少了人工操作的步骤，整个流程仅需6小时，可在一个工作日内轻松制备96份样本。此自动化工作流程为具有挑战性的血浆蛋白质组制备领域提供了一种实用的简化的解决方案，使研究者可以深入了解分子机制，并在小型和大型队列研究中发现生物标志物。